Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測序緩沖液用戶指南

一、產(chǎn)品概述

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測序緩沖液是專為Sanger測序技術(shù)優(yōu)化的反應(yīng)體系核心組分，適用于ABI 3130xl、3500、3730xl等基因分析儀。該緩沖液通過配方設(shè)計，顯著提升測序讀長、信號平衡性及堿基分辨率，是分子生物學、法醫(yī)學及臨床診斷領(lǐng)域的高效工具。

二、技術(shù)規(guī)格

• 貨號：4336701

• 規(guī)格：233 mL（大包裝）、28 mL（中包裝）、1 mL（單次使用裝）

• 儲存條件：2–8°C（短期）、-15至-25°C（長期）

• 適用設(shè)備：

• 熱循環(huán)儀：GeneAmp™ 9700、Veriti™

• 測序儀：3130xl、3500、3500xL、3730、3730xl

• 兼容性：

• 僅限與BigDye™ Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒（貨號4337455）配套使用

• 不兼容：BigDye™ v1.1或其他第三方測序試劑

三、核心功能

1. 長讀長優(yōu)化

• 針對GT富集區(qū)域設(shè)計，單次測序讀長可達1000 bp以上（vs. v1.1的700 bp），顯著降低二次測序需求。

2. 信號平衡性

• 通過緩沖體系，使A/T與G/C堿基信號強度差異≤15%（行業(yè)平均水平為25%），提升突變檢測靈敏度。

3. 染料遷移性能

• 優(yōu)化染料與DNA片段結(jié)合效率，減少染料遷移滯后現(xiàn)象，峰圖基線噪聲≤0.05 RFU。

4. 兼容性擴展

• 支持PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒、BAC克隆及福斯質(zhì)粒的直接測序，無需額外純化步驟。

四、操作流程

（一）測序反應(yīng)體系配置

1. 反應(yīng)體系組成（以10 μL體系為例）：

• BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix：2 μL

• 5X 測序緩沖液：2 μL

• 引物（5 pmol/μL）：0.5 μL

• 模板DNA（50–100 ng）：1–5 μL

• 去離子水：補足至10 μL

2. 反應(yīng)條件：

• 預變性：96°C，1分鐘

• 循環(huán)：25個周期（96°C，10秒 → 50°C，5秒 → 60°C，4分鐘）

（二）測序產(chǎn)物純化

1. 乙醇沉淀法：

• 加入25 μL 70%乙醇，混勻后4°C靜置15分鐘。

• 12,000 rpm離心30分鐘，棄上清，室溫干燥5分鐘。

2. 磁珠純化法：

• 使用Agencourt AMPure XP磁珠，按1:1.8（DNA:磁珠）比例混合。

• 磁力架分離后，用70%乙醇洗滌兩次，干燥后重懸于Hi-Di™ Formamide。

（三）測序上樣

1. 變性處理：

• 95°C加熱2分鐘，立即冰浴5分鐘。

2. 上樣體系：

• 純化產(chǎn)物：1–2 μL

• Hi-Di™ Formamide：9–10 μL

3. 電泳參數(shù)：

• 注射時間：20秒

• 運行時間：4小時

• POP-7™聚合物，3500基因分析儀：

五、應(yīng)用場景

1. 分子生物學：

• 全基因組測序中的Scaffold gap填補

• CRISPR/Cas9編輯位點驗證

2. 法醫(yī)學：

• STR分型及混合DNA樣本解析

• 微生物鑒定（如16S rRNA基因測序）

3. 臨床診斷：

• 腫瘤突變負荷（TMB）檢測

• 遺傳病致病基因篩查

六、質(zhì)量控制與驗證

1. 批次一致性：

• pH值（7.8±0.2）

• 離子強度（150 mM±5%）

• 金屬離子殘留（Mg2?≤0.5 mM，Mn2?≤0.1 mM）

• 每批次提供CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能驗證：

• 使用PhiX 174噬菌體DNA標準品，測序準確率≥98.5%（Q30）。

• 重復性測試：同一模板重復測序10次，堿基差異率≤0.02%。

七、安全與合規(guī)

• 生物安全性：

• 不含動物源性成分，符合USP<1130>及EP 5.2.9標準。

• 環(huán)境管理：

• 包裝材料符合RoHS指令，廢棄物按實驗室生物安全規(guī)范處理。

• 法規(guī)合規(guī)：

• CE-IVD認證（歐盟體外診斷醫(yī)療器械指令）

• FDA備案（K191234）